Извођење четири теста амплификације нуклеинске киселине за идентификацију САРС-ЦоВ-2 у Етиопији

Хвала вам што сте посетили Натуре.цом. Користите верзију претраживача са ограниченом подршком за ЦСС. За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у). Поред тога, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказујемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Приказује вртешку од три слајда одједном. Користите дугмад Претходно и Следеће да бисте се кретали кроз три слајда одједном или користите дугмад клизача на крају да бисте се кретали кроз три слајда одједном.
Од избијања болести корона вируса (ЦОВИД-19) 2019. године, многи комерцијални тестови амплификације нуклеинске киселине (НААТ) развијени су широм света и постали су стандардни тестови. Иако је неколико тестова брзо развијено и примењено на лабораторијске дијагностичке тестове, учинак ових тестова није процењен у различитим окружењима. Стога је ова студија имала за циљ да процени учинак Абботт САРС-ЦоВ-2, Даан Гене, БГИ и Сансуре Биотецх тестова коришћењем композитног референтног стандарда (ЦРС). Студија је спроведена на Етиопском институту за јавно здравље (ЕПХИ) од 1. до 30. децембра 2020. 164 назофарингеална узорка су екстрахована коришћењем КИАамп РНА мини кита и Абботт система за припрему узорака ДНК. Од 164 узорка, 59,1% је било позитивно, а 40,9% негативно на ЦРС. Сансуре Биотецх позитивност је била значајно ниска у поређењу са ЦРС (п < 0,05). Сансуре Биотецх позитивност је била значајно ниска у поређењу са ЦРС (п < 0,05). Положитьние результати Сансуре Биотецх били знатно ниже по сравнениу с ЦРС (п < 0,05). Позитивни резултати Сансуре Биотецх-а били су значајно нижи у поређењу са ЦРС (п < 0,05).与ЦРС 相比，Сансуре Биотецх 的阳性率显着较低 (п < 0,05)与ЦРС 相比，Сансуре Биотецх 的阳性率显着较低 (п < 0,05) У Сансуре Биотецх било знатно мање позитивних резултата по сравњењу с ЦРС (п < 0,05). Сансуре Биотецх је имао значајно мање позитивних резултата у поређењу са ЦРС (п < 0,05).Укупна сагласност четири анализе била је 96,3–100% у поређењу са ЦРС. Поред ниске стопе позитивности Сансуре Биотецх теста, перформансе четири теста су биле скоро упоредиве. Као такав, Сансуре Биотецх [Само за истраживање (РУО)] тест захтева додатну валидацију за његову употребу у Етиопији. Коначно, треба размотрити додатна истраживања како би се проценили тестови са одговарајућим тврдњама произвођача.
Лабораторијско тестирање је део Стратешког плана Светске здравствене организације (СЗО) за спремност и реаговање на болест од корона вируса 2019 (ЦОВИД-19) (СПРП). СЗО саветује да земље треба да изграде лабораторијске капацитете како би побољшале спремност, правилно управљање случајевима, будност и брз одговор на изазове јавног здравља. Ово сугерише да је улога лабораторије кључна за карактеризацију болести и епидемиологије нових инфективних агенаса и контролу њиховог ширења.
Дијагноза ЦОВИД-19 захтева епидемиолошке и медицинске информације, личне симптоме/знакове и радиографске и лабораторијске податке2. Откако је избијање ЦОВИД-19 пријављено у Вухану у Кини, широм света су развијени многи комерцијални тестови за амплификацију нуклеинске киселине (НААТ). Ланчана реакција полимеразе са реверзном транскрипцијом у реалном времену (рРТ-ПЦР) коришћена је као рутинска и стандардна метода за лабораторијску дијагнозу инфекције тешког акутног респираторног синдрома 2 (САРС-ЦоВ-2)3. Молекуларна детекција САРС-ЦоВ-2 се обично заснива на генима Н (ген за нуклеокапсидни протеин), Е (ген за протеин омотача) и РдРп (ген за РНК-зависну РНА полимеразу) у ОРФ1а/б (отворени оквир читања 1а/б) . ген) регион идентификован из вирусног генома. Сматра се да су они главни очувани региони који се налазе у вирусним геномима за препознавање вируса4. Међу овим генима, РдРп и Е гени имају високу аналитичку осетљивост детекције, док Н ген има ниску аналитичку осетљивост5.
Перформансе ПЦР тестова могу да варирају у зависности од различитих фактора као што су: реагенси за екстракцију, реагенси за амплификацију/детекцију, метод екстракције, квалитет ПЦР машине и других инструмената. Од априла 2020. године, више од 48 различитих дијагностичких уређаја из девет земаља добило је одобрење за хитну употребу (ЕУА) за дијагностику ЦОВИД-196. У Етиопији се више од 14 ПЦР платформи у реалном времену користи за ПЦР детекцију САРС-ЦоВ-2 у 26 јавних здравствених установа, укључујући АБИ 7500, Абботт м2000, Роцхе 48000 и Куант-студио7. Поред тога, доступни су различити ПЦР тестни комплети, као што су Даан Гене тест, Абботт САРС-ЦоВ-2 тест, Сансуре Биотецх тест и САРС-ЦоВ-2 БГИ тест. Иако је рРТ-ПЦР веома осетљив, неки пацијенти са ЦОВИД-19 пријављују лажно негативне резултате због недовољних копија вирусне рибонуклеинске киселине (РНА) у узорцима због неправилног сакупљања, транспорта, складиштења и руковања, као и лабораторијског тестирања. услови и радње кадрова8. Поред тога, погрешно руковање узорком или контролом, постављање прага циклуса (Цт) и унакрсна реактивност са другим патогеним нуклеинским киселинама или неактивном/резидуалном САРС-ЦоВ-2 РНК могу довести до лажно позитивних резултата у рРТ-ПЦР9 тестовима. Дакле, јасно је да ПЦР тестови заиста могу да идентификују носиоце фрагмената гена, јер не могу чак ни разликовати истински активне вирусне гене, тако да тестови могу идентификовати само носиоце, а не пацијенте10. Због тога је важно проценити дијагностичке перформансе користећи стандардне методе у нашем окружењу. Иако су многи НААТ реагенси доступни у Етиопском институту за јавно здравље (ЕПХИ) и широм земље, још увек није објављена упоредна процена њихове ефикасности. Стога је ова студија имала за циљ да процени упоредне перформансе комерцијално доступних комплета за откривање САРС-ЦоВ-2 помоћу рРТ-ПЦР-а користећи клиничке узорке.
У ову студију је укључено укупно 164 учесника са сумњом на ЦОВИД-19. Већина узорака била је из центара за лечење (118/164 = 72%), док је преосталих 46 (28%) учесника било из центара за нелечење. Међу учесницима који нису лечени у центру, 15 (9,1%) је имало клинички сумњиве случајеве, а 31 (18,9%) је имало контакте са потврђеним случајевима. Деведесет три (56,7%) учесника су били мушкарци, а средња (± СД) старост учесника била је 31,10 (± 11,82) година.
У овој студији утврђене су позитивне и негативне стопе четири теста на ЦОВИД-19. Тако су позитивне стопе Абботт теста САРС-ЦоВ-2, теста Даан Гене 2019-нЦоВ, САРС-ЦоВ-2 БГИ теста и Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ теста биле 59,1%, 58,5%, 57,9% и 55,5% респективно . Позитивни и негативни резултати композитног референтног стандарда (ЦРС) били су 97 (59,1%) и 67 (40,9%), респективно (Табела 1). У овој студији, дефиниција ЦРС-а је заснована на правилу „било који позитиван“, при чему се од четири резултата теста, два или више резултата теста који су дали исти резултат сматрају истинито позитивним или негативним.
У овој студији смо пронашли негативан проценат сагласности (НПА) од 100% (95% ЦИ 94,6–100) за све анализе у поређењу са ЦРС. Сансуре Биотецхнологи анализа је показала минимални ППА од 93,8% (95% ЦИ 87,2-97,1), а анализа Даан Гене 2019-нЦоВ имала је укупно слагање од 99,4% (95% ЦИ 96,6-99,9). Насупрот томе, укупна сагласност између САРС-ЦоВ-2 БГИ теста и Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ теста износила је 98,8% односно 96,3% (табела 2).
Коенов капа коефицијент слагања између резултата ЦРС и Абботт теста САРС-ЦоВ-2 био је потпуно конзистентан (К = 1,00). Слично томе, Коенове капа вредности које су детектовали Даан Гене 2019-нЦоВ, САРС-ЦоВ-2 БГИ и Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ су такође у потпуности у складу са ЦРС (К ≥ 0,925). У овој упоредној анализи, хи-квадрат тест (МцНемар тест) показао је да су резултати Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ теста значајно другачији од резултата ЦРС (п = 0,031) (Табела 2).
Као што је приказано на сл.1 проценат најниже вредности Цт (< 20 Цт) Абботт теста САРС-ЦоВ-2 (комбиновани ген РдРп и Н) био је 87,6%, а Цт вредност гена ОРФ1а/б за Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ тест је показао да је проценат ниског Цт вредност (< 20 Цт) је била 50,3% и висока вредност Цт (36–40 Цт) износио је 3,2%. 1 проценат најниже вредности Цт (< 20 Цт) Абботт теста САРС-ЦоВ-2 (комбиновани ген РдРп и Н) био је 87,6%, а Цт вредност гена ОРФ1а/б за Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ тест је показао да је проценат ниског Цт вредност (< 20 Цт) је била 50,3% и висока вредност Цт (36–40 Цт) износио је 3,2%.Као што је приказано на сл.1, процент наименьшего значења Цт (< 20 Цт) анализа Абботт САРС-ЦоВ-2 (комбиновани ген РдРп и Н) износила је 87,6%, а вреднотење Цт гена ОРФ1а/б анализе Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ показало что процент ниског значења Цт (< 20 Цт) составлал 50,3%, а високое значение Цт (36–40 Цт) составлало 3,2%. 1, проценат анализе најниже вредности Цт (< 20 Цт) Абботт САРС-ЦоВ-2 (комбиновани ген РдРп и Н) био је 87,6%, а Цт вредност ОРФ1а/б генске анализе Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ је показала да је проценат ниске вредности Цт (< 20 Цт) износио 50,3%, а високе вредности Цт (36–40 Цт) чинило је 3,2%.如图1 所示，Абботт САРС-ЦоВ-2 检测(结合РдРп 和Н 基因）的最低Цт 值百分比уре)（< 20 Цт Биотецх（< 20 Цт. 2019-нЦоВ 检测的ОРФ1а/б 基因Цт 值显示低Цт 值(< 20 Цт) 的百分比为50,3%, 高Цт 值(36)的百分比为3,2%. Као што је приказано на слици 1, најнижи проценат вредности Цт (< 20 Цт) Абботт САРС-ЦоВ-2 теста (комбинација РдРп и Н гена) је 87,6%, вредност Цт гена ОРФ1а/б у Сансуре Биотецх 2019-нЦоВ тесту показује низак Цт值(< 20 Цт) 的 проценат је 50,3%, 高Цт Проценат 值(36–40 Цт) 的 је 3,2%. Како је приказано на цртежу 1, анализа Абботт САРС-ЦоВ-2 (сочетаусиј ген РдРп и Н) има само ниско процентуално вредност Цт (< 20 Цт) у размери 87,6%, а вредност Цт гена ОРФ1а/б у истраживањима Сансуре Биотецх 2019 - Анализ нЦоВ показао низкиј Цт. Као што је приказано на слици 1, Абботт САРС-ЦоВ-2 тест (комбинује РдРп и Н гене) имао је најнижу процентуалну вредност Цт (< 20 Цт) од 87,6%, док је Цт вредност гена ОРФ1а/б у Сансуреу Студија Биотецх 2019 – Анализа нЦоВ показала је низак Цт. Процент значења (< 20 Цт) је износио 50,3%, а процент високих вредности Цт (36–40 Цт) је износио 3,2%. Проценат вредности (< 20 Цт) био је 50,3%, а проценат високих вредности Цт (36–40 Цт) 3,2%.Абботт САРС-ЦоВ-2 Б тест је забележио вредности Цт изнад 30. С друге стране, на БГИ САРС-ЦоВ-2 тесту ген ОРФ1а/б је имао високу вредност Цт (> 36 Цт) проценат је био 4% (слика 1). С друге стране, на БГИ САРС-ЦоВ-2 тесту ген ОРФ1а/б је имао високу вредност Цт (> 36 Цт) проценат је био 4% (слика 1). С друге стране, в анализи БГИ САРС-ЦоВ-2 ген ОРФ1а/б имел високое значение Цт (> 36 Цт), процент которого составлал 4% (рис. 1). С друге стране, у анализи БГИ САРС-ЦоВ-2 ген ОРФ1а/б је имао високу вредност Цт (>36 Цт), чији је проценат износио 4% (Сл. 1).另一方面，在БГИ САРС-ЦоВ-2 检测中，ОРФ1а/б 基因具有高Цт 值（> 36 Цт）的百分%比三、 С друге стране, у детекцији БГИ САРС-ЦоВ-2, проценат гена ОРФ1а/б са високом вредношћу Цт (>36 Цт) је 4% (Слика 1). С друге стране, в анализи БГИ САРС-ЦоВ-2 процента генов ОРФ1а/б с високим значењима Цт (>36 Цт) је износила 4% (рис. 1). С друге стране, у анализи БГИ САРС-ЦоВ-2, проценат гена ОРФ1а/б са високим вредностима Цт (>36 Цт) износио је 4% (слика 1).
У овој студији узели смо 164 узорка назофаринкса. За све типове тестова, изолација и амплификација РНК је извршена коришћењем метода и комплета препоручених од стране одговарајућих произвођача.
Ова студија је показала да Аботов тест за САРС-ЦоВ-2 има исте перформансе детекције као ЦРС, са 100% позитивном, негативном и укупном подударношћу. Коенов капа споразум је 1.00, што указује на потпуну сагласност са ЦРС-ом. Слична студија Универзитета у Вашингтону у САД открила је да је укупна осетљивост и специфичност Аботовог теста на САРС-ЦоВ-2 била 93% и 100%, респективно, у поређењу са лабораторијски утврђеним тестом (ЛДА) ЦДЦ-а. . 11. Абботтов систем за детекцију САРС-ЦоВ-2 заснива се на истовременој комбинованој детекцији Н и РдРп гена, пошто су оба гена осетљивија, што минимизира лажне негативне резултате12. Студија у Бечу, у Аустрији, такође је показала да велике запремине узорака за екстракцију и запремине елуента за детекцију минимизирају ефекте разблаживања и повећавају ефикасност детекције13. Дакле, Абботтово савршено подударање са САРС-ЦоВ-2 тестом може бити повезано са системом за детекцију платформе који истовремено детектује комбинаторне гене, екстрахује велики број узорака (0,5 мл) и користи велику количину елуента (40 µл).
Наши резултати су такође показали да је учинак детекције Даан генетског теста био скоро исти као код ЦРС-а. Ово је у складу са студијом14 спроведеном на Универзитету Анхуи у Хуаинану, Кина, и тврдњом произвођача о 100% позитивном слагању. Упркос извештајима о доследним резултатима, један узорак је био лажно негативан након поновног тестирања истог елуата, али је био позитиван у Абботт САРС-ЦоВ-2 и Сансуре Биотецх нЦоВ-2019 тестовима. Ово сугерише да може постојати варијабилност у резултатима у различитим типовима тестова. Ипак, у студији спроведеној у Кини15, резултат Даан Гене теста је био значајно другачији (п < 0,05) у поређењу са њиховим референтним тестом дефинисаним у лабораторији. Ипак, у студији спроведеној у Кини15, резултат Даан Гене теста је био значајно другачији (п < 0,05) у поређењу са њиховим референтним тестом дефинисаним у лабораторији. Тем не менее, в исследовании, спроведеном в Китае15, резултат анализе Даан Гене знатно отличалса (п < 0,05) от их лабораторијского еталонного анализе. Међутим, у студији у Кини15, резултат анализе Даан Генеа био је значајно другачији (п < 0,05) од њихове лабораторијске референтне анализе.然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（п < 0,05).然而,在中国进行的研究中15,大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Међутим, в исследовании, проведеном в Китае15, результати генетического теста Даан знатно отличались (п < 0,05) по сравнениу с его еталонним лабораторијским тестом. Међутим, у једној студији у Кини15, резултати Даановог генетског теста били су значајно другачији (п < 0,05) у поређењу са његовим референтним лабораторијским тестом.Ово одступање може бити због осетљивости референтног теста за откривање САРС-ЦоВ-2, а даље студије могу бити важне да би се утврдио узрок.
Поред тога, наша студија је проценила упоредни учинак САРС-ЦоВ-2 БГИ теста са ЦРС, показујући одлично позитивно процентуално слагање (ППА = 97,9%), негативно процентуално слагање (НПА = 100%) и укупно слагање у процентима према полу ( ОПА). ). = 98,8%). Коенове Капа вредности су показале добро слагање (К = 0,975). Студије у Холандији16 и Кини15 показале су доследне резултате. САРС-ЦоВ-2 БГИ тест је тест детекције једног гена (ОРФ1а/б) коришћењем 10 µл елуата за амплифицирање/детекцију. Упркос доброј статистичкој сагласности са нашим референтним резултатима, анализа је пропустила два позитивна узорка (1,22%) од укупног узорка. Ово може имати огромне клиничке импликације за динамику преноса и на нивоу пацијента и на нивоу заједнице.
Још једна компаративна анализа укључена у ову студију је Сансуре Биотецх нЦоВ-2019 рРТ-ПЦР (РУО) тест; укупан проценат утакмица је био 96,3%. Јачина слагања је такође одређена Коеновом капа вредношћу, која је износила 0,925, што указује на потпуно слагање са ЦРС. Опет, наши резултати су идентични студијама спроведеним на Универзитету Централ Соутх у Чангши, Кина, и на Одељењу клиничке лабораторије Народне болнице Лиузхоу, град Лиузхоу, Кина17. Иако је забележена горе наведена добра статистичка подударност, хи-квадрат тест (МацНемар тест) је показао да је резултат Сансуре Биотецх теста имао статистички значајну разлику у поређењу са ЦРС (п < 0,005). Иако је забележена горе наведена добра статистичка подударност, хи-квадрат тест (МацНемар тест) је показао да је резултат Сансуре Биотецх теста имао статистички значајну разлику у поређењу са ЦРС (п < 0,005). Без обзира на то, что било зафиксировано указано више доброе статистическое соответствие, критеријум хи-квадрата (критериј Макнемара) показао, что резултат анализе Сансуре Биотецх има статистички значајное разлике по сравњењу с ЦРС (п < 0,005). Иако је забележено добро статистичко слагање изнад, хи-квадрат тест (МцНемар тест) је показао да је резултат Сансуре Биотецх теста имао статистички значајну разлику у поређењу са ЦРС (п < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验 (МацНемар 检验)）表明, ЦР, Сансуре Биотецх相比具有统计学显着差异 (п < 0,005).尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（мацнемар 检验 表明 ， ， санс биотецх与 црс 相比 具有 显着 （(п <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Не все на отмеченное више хорошее статистическое соответствие, критеријум хи-квадрата (критериј Макнемара) показао статистически значајну разницу (п < 0,005) између анализе Сансуре Биотецх и ЦРС. Упркос добром статистичком слагању горе наведеном, хи-квадрат тест (МцНемар тест) показао је статистички значајну разлику (п < 0,005) између Сансуре Биотецх теста и ЦРС.Утврђено је да су шест узорака (3,66%) лажно негативни у поређењу са ЦРС (додатна табела 1); ово је веома важно, посебно с обзиром на динамику преношења вируса. Горе наведени подаци такође подржавају ову ниску стопу откривања15.
У овој студији, вредности Цт су одређене за сваки тест и одговарајућу платформу, са најнижом средњом вредношћу Цт која је пријављена у Абботт тесту САРС-ЦоВ-2. Овај резултат може бити повезан са Аботовим симултаним комбинованим системом генетског тестирања за откривање САРС-ЦоВ-2. Према томе, према слици 1, 87,6% резултата компаније Абботт САРС-ЦоВ-2 имало је Цт вредности испод 20. Само мали број резултата узорка (12,4%) био је у опсегу 20-30. Цт вредности изнад 30 нису забележене. Поред тога што Абботт користи формат за панел генетско тестирање САРС-ЦоВ-2, овај резултат може бити повезан са доњом границом детекције (32,5 РНК копија/мЛ)18, која је три пута нижа од доње границе компаније од 100 РНК копија /мЛ. мл)19.
Ова студија има нека ограничења: прво, немамо стандардне/референтне методе [као што су вирусно оптерећење или други лабораторијски тестови (ЛДА)] због недостатка ресурса. Друго, сви узорци коришћени у овој студији били су назофарингеални брисеви, док резултати нису били применљиви на друге типове узорака, и треће, величина нашег узорка је била мала.
Ова студија је упоредила перформансе четири рРТ-ПЦР теста за САРС-ЦоВ-2 користећи узорке назофаринкса. Сви тестови детекције имали су скоро упоредиве перформансе, са изузетком Сансуре Биотецх теста. Поред тога, ниска стопа позитивности је идентификована у Сансуре Биотецх тесту у поређењу са ЦРС (п < 0,05). Поред тога, ниска стопа позитивности је идентификована у Сансуре Биотецх тесту у поређењу са ЦРС (п < 0,05). Осим тога, у тесту Сансуре Биотецх био је показао низки процент позитивних резултата по сравњењу са ЦРС (п < 0,05). Поред тога, Сансуре Биотецх тест је показао низак проценат позитивних резултата у поређењу са ЦРС (п < 0,05).此外, 与ЦРС 相比, Сансуре Биотецх 检测的阳性率较低(п < 0,05).此外, 与ЦРС 相比, Сансуре Биотецх 检测的阳性率较低(п < 0,05). Осим тога, анализа Сансуре Биотецх има более низкиј уровень позитивних резултата по сравњењу са ЦРС (п < 0,05). Поред тога, Сансуре Биотецх тест је имао нижу стопу позитивности у поређењу са ЦРС (п < 0,05).Сансуре Биотецх нЦоВ-2019 (РУО) анализа ППА, НПА и укупног слагања премашила је 93,5% са Цохен Каппа јачином слагања од 0,925. Коначно, Сансуре Биотецх Ассаи (РУО) треба даљу валидацију за употребу у Етиопији, а потребно је размотрити додатна истраживања како би се процениле тврдње појединачних произвођача.
Упоредни дизајн студије спроведен је у четири здравствене установе у Адис Абеби, болници Ека Котебе, Центру за лечење цркве Миленијум, Меморијалној болници Зевоодиту и Специјалистичкој болници за туберкулозу Светог Петра. Подаци су прикупљени од 1. до 31. децембра 2020. Медицинске установе за ову студију су намерно одабране на основу њиховог великог броја случајева и доступности већих центара за лечење у граду. Слично томе, инструменти, укључујући инструменте за ПЦР у реалном времену АБИ 7500 и Абботт м2000, одабрани су према препорукама произвођача НААТ реагенса, а четири комплета за ПЦР детекцију су одабрана за ову студију, пошто је већина лабораторија у Етиопији користила најмање најмање њих четири. Генски тест, Абботт САРС-ЦоВ-2 тест, Сансуре Биотецх тест и САРС-ЦоВ-2 БГИ тест обављен током студије).
Тестирање на САРС-ЦоВ-2 обављено је од 1. до 30. децембра 2020. коришћењем 3 мл вирусног транспортног медијума (ВТМ) (Мирацлеан Тецхнологи, Шенжен, Кина) од појединаца под истрагом за ЦОВИД-19 упућених ЕПХИ. Назофарингеалне узорке су сакупили обучени сакупљачи узорака и послати у ЕПХИ у троструким паковањима. Пре изолације нуклеинске киселине, сваком узорку се додељује јединствени идентификациони број. Екстракција се врши из сваког узорка одмах по доласку користећи ручне и аутоматске методе екстракције. Дакле, за аутоматску екстракцију Абботт м2000, 1,3 мл (укључујући 0,8 мл мртве запремине и 0,5 мл улазне запремине екстракције) узорка је екстраховано из сваког узорка и пропуштено кроз Абботт ДНК систем за припрему узорака (Абботт Молецулар Инц. дес Плаинес, ИЛ, САД). ) Серија од 96 [92 узорка, две контроле за откривање и две контроле без шаблона (НТЦ)] је укључена у целокупни процес (преузимање и откривање) две рунде САРС-ЦоВ-2 (ЕУА) у реалном времену. рударство. Слично томе, за ручно вађење, користите исте узорке (за аутоматско извлачење и откривање). Дакле, током целог процеса, 140 µл узорака је подељено на аликвоте и екстраховано коришћењем КИАамп Вирал РНА Мини Кит (КИАГЕН ГмбХ, Хилден, Немачка) у серијама од 24 (укључујући 20 узорака, две контролне анализе и два НТЦ) током девет рунди. Ручно екстраховани елуати су појачани и детектовани коришћењем АБИ 7500 термалног циклуса коришћењем САРС-ЦоВ-2 БГИ теста, Даан Гене теста и Сансуре Биотецх теста.
Аутоматска изолација и пречишћавање вирусне РНК САРС-ЦоВ-2 прати принцип магнетне куглице користећи Абботт ДНК реагенс за припрему узорака. Инактивација узорака и солубилизација вирусних честица се врши коришћењем детерџента који садржи гванидин изотиоцијанат да би се протеин денатурисао и инактивирала РНКаза. РНК се затим одваја од протеина раздвајањем чврсте фазе коришћењем силицијум диоксида, тј. гванидинијумове соли и алкални пХ пуфера за лизу промовишу везивање нуклеинских киселина за силицијум диоксид (СиО2). Корак испирања уклања преостале протеине и остатке да би се добио бистар раствор. Транспарентна РНК је изолована од микрочестица на бази силицијум-диоксида коришћењем магнетног поља инструмента20,21. С друге стране, ручна изолација и пречишћавање РНК се врши методом спин колоне коришћењем центрифугирања уместо магнетног постоља и одвајања микрочестица од елуента.
Абботтов тест детекције САРС-ЦоВ-2 у реалном времену (Абботт Молецулар, Инц.) изведен је према упутствима произвођача, који су од СЗО и ФДА добили ЕУА19,22. У овом протоколу, инактивација узорка пре екстракције изведена је у воденом купатилу на 56 ° Ц током 30 мин. Након инактивације вируса, екстракција нуклеинске киселине је изведена на Абботт м2000 СП инструменту од 0,5 мл ВТМ користећи Абботт м2000 систем за припрему узорака ДНК. према произвођачу. Амплификација и детекција су обављени коришћењем Абботт м2000 РТ-ПЦР инструмента, а двострука детекција је извршена за РдРп и Н гене. РОКС) и ВИЦ П (заштићена боја) за циљање и детекцију интерних контрола, омогућавајући истовремено откривање оба производа за појачавање 19 .
Метода детекције амплификације овог комплета заснована је на РТ-ПЦР технологији у једном кораку. ОРФ1а/б и Н гени су одабрани као конзервирани региони помоћу Даан Гене Тецхнологи за откривање амплификације циљног региона. Специфични прајмери ​​и флуоресцентне сонде (Н генске сонде означене са ФАМ, ОРФ1а/б сонде означене са ВИЦ) су дизајниране да детектују САРС-ЦоВ-2 РНК у узорцима. Коначни елуент и мастер мешавине су припремљене додавањем 5 µл елуента на 20 µл главне мешавине до коначне запремине од 25 µл. Амплификација и детекција су обављени истовремено на АБИ 750024 ПЦР инструменту у реалном времену.
ОРФ1а/б и Н гени су откривени коришћењем комплета за дијагностику нуклеинске киселине Сансуре Биотецх нЦоВ-2019 (флуоресцентна ПЦР детекција). Припремите специфичне сонде за сваки циљни ген тако што ћете изабрати ФАМ канал за ОРФ1а/б регион и РОКС канал за Н ген. Овом комплету за анализу, елуент и реагенси за главну мешавину се додају на следећи начин: припремите 30 µл реагенса главне мешавине и 20 µл елуираног узорка за детекцију/амплификацију. ПЦР у реалном времену АБИ 750025 је коришћен за амплификацију/детекцију.
САРС-ЦоВ-2 БГИ тест је флуоресцентни рРТ-ПЦР комплет у реалном времену за дијагнозу ЦОВИД-19. Циљни регион се налази у ОРФ1а/б региону генома САРС-ЦоВ-2, што је метода детекције једног гена. Поред тога, људски ген за одржавање домаћинства β-актин је интерно регулисан циљни ген. Главна мешавина се припрема мешањем 20 µл реагенса мастер мешавине и 10 µл екстрахованог узорка РНК у плочи са бунарима26. За амплификацију и детекцију је коришћен АБИ 7500 флуоресцентни квантитативни ПЦР инструмент у реалном времену. Сва амплификација нуклеинске киселине, услови рада ПЦР-а за сваки тест и интерпретација резултата су обављени према упутствима одговарајућег произвођача (Табела 3).
У овој компаративној анализи нисмо користили метод референтног стандарда за одређивање процента слагања (позитивног, негативног и укупног) и других параметара поређења за четири анализе. Свако поређење теста је рађено са ЦРС, у овој студији ЦРС је постављен по правилу „било који позитиван“ и резултат је одређен, а не једним тестом, користили смо најмање два подударна резултата теста. Поред тога, у случају преношења ЦОВИД-19, лажно негативни резултати су опаснији од лажно позитивних. Према томе, да бисмо што прецизније рекли „позитивно“ из резултата ЦРС, најмање два теста морају бити позитивна, што значи да ће најмање један позитиван резултат вероватно доћи из ЕУА теста. Дакле, од четири резултата теста, два или више резултата теста који дају исти резултат сматрају се истинито позитивним или негативним18,27.
Подаци су прикупљени коришћењем структурираних образаца за екстракцију података, унос и анализа података су обављени коришћењем статистичког софтвера Екцел и СПСС верзије 23.0 за дескриптивну статистику. Анализирани су позитивни, негативни и укупни проценат слагања, а Каппа скор је коришћен за одређивање степена слагања сваке методе са ЦРС. Капа вредности се тумаче на следећи начин: 0,01 до 0,20 за благи договор, 0,21 до 0,40 за опште слагање, 0,41-0,60 за умерено слагање, 0,61-0,80 за већи договор и 0,81-0,99 за потпуни договор28.
Етичко одобрење добијено је од Универзитета у Адис Абеби, а све експерименталне протоколе за ову студију је одобрио Одбор за научну етику Етиопског института за јавно здравље. Референтни број за ЕПХИ етичку лиценцу је ЕПХИ/ИРБ-279-2020. Све методе су примењене у складу са препорукама и одредбама Етиопских националних свеобухватних смерница за лечење ЦОВИД-19. Поред тога, добијен је писмени информисани пристанак од свих учесника студије пре учешћа у студији.
Сви подаци добијени или анализирани у овој студији укључени су у овај објављен чланак. Подаци који подржавају резултате ове студије доступни су од одговарајућег аутора на разуман захтев.
Светска здравствена организација. Препоруке за стратегије лабораторијског тестирања на ЦОВИД-19: Привремене смернице, 21. март 2020. бр. ВХО/2019-нЦоВ/лаб_тестинг/2020.1 (СЗО, 2020).
Моулиоу, ДС, Пантазопоулос, И. & Гоургоулианис, КИ Паметна дијагноза ЦОВИД-19 у одељењу за хитне случајеве: Алл-ин у пракси. Моулиоу, ДС, Пантазопоулос, И. & Гоургоулианис, КИ Паметна дијагноза ЦОВИД-19 у одељењу за хитне случајеве: Алл-ин у пракси.Мулиоу, ДС, Пантазопоулос, И. и Гургулианис, КИ Интелигентна дијагноза ЦОВИД-19 у одељењу хитне помоћи: све у пракси.Мулиоу ДС, Пантазопоулос И. и Гургулианис КИ Интелигентна дијагноза ЦОВИД-19 у одељењима за хитне случајеве: енд-то-енд интеграција у пракси. Експерт велечасни Респире. лек. 3, 263–272 (2022).
Митцхелл, СЛ & Ст Георге, К. Евалуација ЦОВИД19 ИД НОВ ЕУА теста. Митцхелл, СЛ & Ст Георге, К. Евалуација ЦОВИД19 ИД НОВ ЕУА теста.Митцхелл, СЛ и Ст. Георге, К. Евалуација ЦОВИД19 ИД НОВ ЕУА теста.Митцхелл СЛ и Ст. Георге К. Евалуација ЦОВИД19 ИД НОВ ЕУА теста. Ј. Цлиницал. Вирус. 128, 104429. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.јцв.2020.104429 (2020).
СЗО. Лабораторијско откривање корона вирусне болести 2019 (ЦОВИД-19) код сумње на болест код људи. хттпс://ввв.вхо.инт/публицатионс/и/итем/10665-331501 (приступљено 15. августа 2020.) (СЗО, 2020.).
Удугама, Б. ет ал. Дијагноза ЦОВИД-19: болести и алати за тестирање. АЦС Нано 14(4), 3822–3835 (2020).
Сиед С. ет ал. Оснивање Колеџа патолога источне, централне и јужне Африке – Регионална школа за патологију Блиског истока и Јужне Африке. Африка. Ј. Лаб. лек. 9(1), 1-8 (2020).
Етиопски институт за јавно здравље, Федерално министарство здравља. Привремена национална стратегија и упутства за лабораторијску дијагностику ЦОВИД-19. хттпс://епхи.гов.ет/имагес/новел_цоронавирус/ЕПХИ_ПХЕОЦ_ЦОВИД-19_Лаборатори_Диагносис_Енг.пдф (приступљено 12. августа 2020) (ЕПХИ, 2020).
Волосхин, С., Пател, Н. & Кесселхеим, АС Лажно негативни тестови на изазове и импликације инфекције САРС-ЦоВ-2. Волосхин, С., Пател, Н. & Кесселхеим, АС Лажно негативни тестови на изазове и импликације инфекције САРС-ЦоВ-2.Волосхин С., Пател Н. и Кесселхеим АС Лажно негативни тестови на инфекције САРС-ЦоВ-2 и њихове последице.Волосхин С., Пател Н. и Кесселхеим АС Лажно негативни тестови на провокацију и утицај инфекције САРС-ЦоВ-2. Н. енг. Ј. Медицине. 383(6), е38 (2020).
Моулиоу, ДС & Гоургоулианис, КИ Лажно позитивни и лажно негативни случајеви ЦОВИД-19: Респираторна превенција и стратегије управљања, вакцинација и даље перспективе. Моулиоу, ДС & Гоургоулианис, КИ Лажно позитивни и лажно негативни случајеви ЦОВИД-19: Респираторна превенција и стратегије управљања, вакцинација и даље перспективе. Моулиоу, ДС & Гоургоулианис, КИ Ложнопозитивние и ложноотрицательние случаи ЦОВИД-19: респираторна профилакса и стратегии лечениа, вакцинациа и даљње перспективе. Моулиоу, ДС & Гоургоулианис, КИ Лажно позитивни и лажно негативни случајеви ЦОВИД-19: респираторна превенција и стратегије лечења, вакцинација и пут даље.Мулиу, ДС и Гургулианис, КИ Лажно позитивни и лажно негативни случајеви ЦОВИД-19: стратегије за респираторну превенцију и лечење, вакцинацију и пут напред. Експерт велечасни Респире. лек. 15(8), 993–1002 (2021).
Моулиоу, ДС, Иоаннис, П. & Константинос, Г. Дијагноза ЦОВИД-19 у одељењу хитне помоћи: Видети дрво, али изгубити шуму. Моулиоу, ДС, Иоаннис, П. & Константинос, Г. Дијагноза ЦОВИД-19 у одељењу хитне помоћи: Видети дрво, али изгубити шуму.Моулиоу, ДС, Иоаннис, П. и Константинос, Г. ЦОВИД-19 Дијагноза у хитној помоћи: Види дрво, изгуби шуму.Мулиоу ДС, Иоаннис П. и Константинос Г. Дијагноза ЦОВИД-19 у хитним собама: Није довољно шуме за дрвеће. појави се. лек. Ј. хттпс://дои.орг/10.1136/емермед-2021-212219 (2022).
Дегли-Ангели, Е. ет ал. Валидација и валидација аналитичких и клиничких перформанси Абботт теста САРС-ЦоВ-2 у реалном времену. Ј. Цлиницал. Вирус. 129, 104474. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.јцв.2020.104474 (2020).
Моллаеи, ХР, Афсхар, АА, Калантар-Неиестанаки, Д., Фазлалипоур, М. & Афлатоониан, Б. Поређење пет сетова прајмера из различитих региона генома ЦОВИД-19 за откривање вирусне инфекције конвенционалним РТ-ПЦР. Моллаеи, ХР, Афсхар, АА, Калантар-Неиестанаки, Д., Фазлалипоур, М. & Афлатоониан, Б. Поређење пет сетова прајмера из различитих региона генома ЦОВИД-19 за откривање вирусне инфекције конвенционалним РТ-ПЦР.Моллаеи, ХР, Афсхар, АА, Калантар-Неиестанаки, Д., Фазлалипоур, М. и Афлатуниан, Б. Поређење пет сетова прајмера из различитих региона ЦОВИД-19 генома за детекцију вирусне инфекције конвенционалним РТ-ПЦР. Моллаеи, ХР, Афсхар, АА, Калантар-Неиестанаки, Д., Фазлалипоур, М. & Афлатоониан, Б. 比较来自ЦОВИД-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规РТ-ПЦР 检测病毒感染。 Моллаеи, ХР, Афсхар, АА, Калантар-Неиестанаки, Д., Фазлалипоур, М. & Афлатоониан, Б. Поређење 5 различитих генетских региона ЦОВИД-19 за откривање вирусне инфекције конвенционалном РТ-ПЦР.Моллаеи ХР, Афсхар АА, Калантар-Неиестанаки Д, Фазлалипоур М. и Афлатуниан Б. Поређење пет сетова прајмера из различитих региона ЦОВИД-19 генома за детекцију вирусне инфекције конвенционалном РТ-ПЦР.Иран. Ј. Мицробиологи. 12(3), 185 (2020).
Гоертзер, И. ет ал. Прелиминарни резултати националног програма екстерне процене квалитета за откривање секвенци генома САРС-ЦоВ-2. Ј. Цлиницал. Вирус. 129, 104537. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.јцв.2020.104537 (2020).
Ванг, М. ет ал. Аналитицал Евалуатион оф тхе Еффицаци оф Фиве РТ-ПЦР Китс фор Севере Ацуте Респиратори Синдроме Цоронавирус 2. Ј. Цлиницал. лабораторија. анус. 35(1), е23643 (2021).
Ванг Б. ет ал. Процена седам комерцијално доступних комплета за откривање РНК САРС-ЦоВ-2 у Кини на основу ланчане реакције полимеразе (ПЦР) у реалном времену. клинички. Хемијски. лабораторија. лек. 58(9), е149–е153 (2020).
ван Цастерен, ПБ ет ал. Поређење седам комерцијалних РТ-ПЦР дијагностичких комплета за ЦОВИД-19. Ј. Цлиницал. Вирус. 128, 104412 (2020).
Лу, Иу, ет ал. Поређење дијагностичких перформанси два ПЦР комплета за детекцију САРС-ЦоВ-2 нуклеинских киселина. Ј. Цлиницал. лабораторија. анус. 34(10), е23554 (2020).
Лефарт, ПР, итд. Компаративна студија четири САРС-ЦоВ-2 платформе за тестирање амплификације нуклеинске киселине (НААТ) показала је да су перформансе ИД НОВ значајно смањене у зависности од пацијента и типа узорка. дијагноза. микробиологија. Инфецт. дисс. 99(1), 115200 (2021).
Абботт молекул. Абботтов пакет за анализу САРС-ЦоВ-2 у реалном времену. хттпс://ввв.молецулар.абботт/ус/ен/продуцтс/инфецтиоус-дисеасе/РеалТиме-САРС-ЦоВ-2-Ассаи. 1-12. (Од 10. августа 2020.) (2020.).
Клеин, С. ет ал. САРС-ЦоВ-2 РНК изолација коришћењем магнетних перли за брзо откривање великих размера помоћу РТ-кПЦР и РТ-ЛАМП. Вирус 12(8), 863 (2020).