Фактори сметњи у ПЦР реакцијама

Током ПЦР реакције често се сусрећу неки умерени фактори.
Због веома високе осетљивости ПЦР, сматра се да је контаминација један од најважнијих фактора који утичу на резултате ПЦР-а и може да произведе лажне позитивне резултате.
Једнако је критично различити извори који доводе до лажних негативних резултата. Ако су један или више битних делова ПЦР смеше или саме реакције појачања инхибиран или ометају, дијагностички тест се може ометати. То може довести до смањене ефикасности и чак лажних негативних резултата.
Поред инхибиције, губитак циљане интегритет нуклеинске киселине може се појавити због услова слања и / или складиштења пре припреме узорка. Нарочито, високе температуре или неадекватно складиштење могу довести до оштећења ћелија и нуклеинских киселина. Учвршћивање ћелије и ткива и парафинско уграђивање су добро познати узроци фрагментације ДНК и упорни проблем (види слике 1 и 2). У тим случајевима, чак и оптимална изолација и пречишћавање неће помоћи.

Слика 1 | Утицај имобилизације на интегритет ДНК
Електрофореза Агаросе Гел показала је да је квалитет ДНК изолован из парафинских делова обдукције. ДНК различите просечне дужине фрагмента била је присутна у екстрактима у зависности од начина фиксације. ДНК је сачувана само када је фиксирана у домаћим замрзнутим узорцима и у пуферираном неутралном формалину. Употреба снажно киселог боуин фиксатива или неб небуфферираног формалина који садржи форматичну киселину резултирала је значајном губитком ДНК. Преостали део је веома фрагментиран.
Са леве стране дужина фрагмената изражена је у паровима килобазова (КБП)

Слика 2 | Губитак интегритета циљева нуклеинске киселине
(а) Јаз од 3'-5 'на оба стаза резултираће паузом у циљни ДНК. Синтеза ДНК ће се и даље јавити на малим фрагментом. Међутим, ако се на ДНК фрагменту недостаје сајт за жарења за прајмер, долази само линеарно појачање. У најповољнијем случају, фрагменти могу је једни друге да се преносе, али приноси ће бити мали и испод нивоа детекције.
(б) Губитак база, углавном због дискусирања и димера тимидина, доводи до смањења броја Х-обвезница и смањење ТМ-а. Током издужене фазе загревања, прајмери ​​ће се растопити од Матрик ДНК и неће се жанити чак ни под мање строгим условима.
(ц) суседне базе тимина формирају ТТ димер.
Други уобичајени проблем који се често јавља у молекуларној дијагностици је мање од оптимално ослобађање циљних нуклеинских киселина у поређењу са вађењем фенол-хлороформа. У екстремним случајевима то се може повезати са лажним негативима. Много времена се може сачувати кључањем лизе или ензимским варењем ћелијских крхотина, али ова метода често резултира ниским ПЦР осетљивошћу због недовољне ослобађања од недовољне киселине.

Инхибиција активности полимеразе током појачања

Генерално, инхибиција се користи као контејнерски концепт за описивање свих фактора који доводе до супоптималних резултата ПЦР-а. У строго биохемијском смислу, инхибиција је ограничена на активност ензима, тј. Смањује или спречава претворбу подстрата-производа путем интеракције са активним мјестом ДНК полимеразе или његове кофактор (нпр. Мг2 + за ТАК ДНК полимеразу).
Компоненте у узорку или различитим међуспремникама и екстрактима који садрже реагенсе могу директно инхибирати ензим или заробити своје кофактере (нпр. ЕДТА), инаковање инактивирање полимеразе и заузврат који воде до смањене или лажне негативне резултате ПЦР-а.
Међутим, многе интеракције између реакционих компоненти и нуклеинских киселина које садрже циљне су и означене као "ПЦР инхибитори". Једном када се интегритет ћелије поремети изолацијом и нуклеинска киселина се ослобађа, могу се догодити интеракције између узорка и њеног околног раствора и чврсте фазе. На пример, "Сцавенгерс" могу да се баве јединственим или двоструким ДНК кроз не-ковалентне интеракције и ометају изолацију и пречишћавање смањењем броја циљева који на крају стижу до прц реакционог пловила.
Генерално, инхибитори ПЦР-а присутни су у већини телесних течности и реагенса који се користе за клиничке дијагностичке тестове (уреа у урину, хемоглобину и хепарин у крви), додаци исхрани (органским компонентама, гликогентима, гликогентима, гликогенима, гликогенима, гликоген, масноћом, ЦА2 + јони) и компоненте у околини , тешки метали)

Превладаванији ПЦР инхибитори могу се наћи у бактеријама и еукариотским ћелијама, нефарни ДНК, макромолекулама који везују ДНК и лабораторијске опреме као што су рукавице и пластике. Пречишћавање нуклеинских киселина током или након екстракције је пожељна метода за уклањање ПЦР инхибитора.
Данас, разна аутоматизована опрема за вађење може заменити бројне ручне протоколе, али 100% опоравак и / или пречишћавање циљева никада није постигнуто. Потенцијални инхибитори и даље могу бити присутни у пречишћеним нуклеинским киселинама или су можда већ ступили на снагу. Постоје различите стратегије за смањење утицаја инхибитора. Избор одговарајуће полимеразе може имати значајан утицај на активност инхибитора. Остале проверене методе за смањење инхибиције ПЦР повећавају концентрацију полимеразе или примењују адитива као што је БСА.
Инхибиција ПЦР реакција може се показати употребом интерне контроле квалитета процеса (ИПЦ).
Морате се узети за уклањање свих реагенса и других решења у комплету за екстракцију, као што је Етанол, ЕДТА, ЦЕТАБ, ЛИЦЛ, ГУСЦН, СДС, изопропанол и фенол из изолације нуклеинске киселине темељним кораком прања. У зависности од концентрације, они могу активирати или инхибирати ПЦР.