Фактори интерференције у ПЦР реакцијама

Током ПЦР реакције често се сусрећу неки ометајући фактори.
Због веома високе осетљивости ПЦР-а, контаминација се сматра једним од најважнијих фактора који утичу на резултате ПЦР-а и може дати лажно позитивне резултате.
Једнако су критични различити извори који доводе до лажно негативних резултата. Ако су један или више битних делова ПЦР смеше или сама реакција амплификације инхибирани или ометани, дијагностички тест може бити ометен. То може довести до смањене ефикасности, па чак и лажно негативних резултата.
Поред инхибиције, може доћи до губитка интегритета циљне нуклеинске киселине због услова транспорта и/или складиштења пре припреме узорка. Конкретно, високе температуре или неадекватно складиштење могу довести до оштећења ћелија и нуклеинских киселина. Фиксација ћелија и ткива и уградња парафина су добро познати узроци фрагментације ДНК и упорни проблем (видети слике 1 и 2). У овим случајевима, чак ни оптимална изолација и пречишћавање неће помоћи.

Слика 1 | Утицај имобилизације на интегритет ДНК
Електрофореза у агарозном гелу показала је да се квалитет ДНК изоловане из парафинских секција обдукција значајно разликује. ДНК различите просечне дужине фрагмената је била присутна у екстрактима у зависности од методе фиксације. ДНК је сачувана само када је фиксирана у нативним замрзнутим узорцима и у пуферованом неутралном формалину. Употреба јако киселог Боуин фиксатора или непуферованог формалина који садржи мрављу киселину довела је до значајног губитка ДНК. Преостала фракција је веома фрагментирана.
Са леве стране, дужина фрагмената је изражена у паровима килобаза (кбп)

Слика 2 | Губитак интегритета мета нуклеинске киселине
(а) Размак од 3′-5′ на оба ланца резултираће прекидом у циљној ДНК. синтеза ДНК ће се и даље одвијати на малом фрагменту. Међутим, ако место жарења прајмера недостаје на фрагменту ДНК, долази само до линеарне амплификације. У најповољнијем случају, фрагменти могу поново засићени једни другима, али ће приноси бити мали и испод нивоа детекције.
(б) Губитак база, углавном услед депуринације и формирања тимидин димера, доводи до смањења броја Х-веза и смањења Тм. Током продужене фазе загревања, прајмери ​​ће се истопити од матричне ДНК и неће се жарити чак ни под мање строгим условима.
(ц) Суседне базе тимина формирају ТТ димер.
Још један уобичајени проблем који се често јавља у молекуларној дијагностици је мање од оптималног ослобађања циљних нуклеинских киселина у поређењу са екстракцијом фенол-хлороформом. У екстремним случајевима, ово може бити повезано са лажним негативним резултатима. Много времена се може уштедети лизом кључања или ензимском варењем ћелијских остатака, али овај метод често резултира ниском ПЦР осетљивошћу због недовољног ослобађања нуклеинске киселине.

Инхибиција активности полимеразе током амплификације

Генерално, инхибиција се користи као концепт контејнера за описивање свих фактора који доводе до субоптималних ПЦР резултата. У строго биохемијском смислу, инхибиција је ограничена на активност ензима, тј. смањује или спречава конверзију супстрата у производ кроз интеракцију са активним местом ДНК полимеразе или њеним кофактором (нпр. Мг2+ за Так ДНК полимеразу).
Компоненте у узорку или различити пуфери и екстракти који садрже реагенсе могу директно инхибирати ензим или ухватити његове кофакторе (нпр. ЕДТА), чиме инактивирају полимеразу и заузврат доводе до смањених или лажно негативних ПЦР резултата.
Међутим, многе интеракције између компоненти реакције и нуклеинских киселина које садрже циљ су такође означене као 'ПЦР инхибитори'. Када се интегритет ћелије поремети изолацијом и нуклеинска киселина се ослободи, може доћи до интеракције између узорка и његовог околног раствора и чврсте фазе. На пример, 'чистачи' могу да вежу једноланчану или дволанчану ДНК кроз нековалентне интеракције и ометају изолацију и пречишћавање смањењем броја мета које на крају стигну до ПЦР реакционог суда.
Генерално, ПЦР инхибитори су присутни у већини телесних течности и реагенаса који се користе за клиничке дијагностичке тестове (уреа у урину, хемоглобин и хепарин у крви), дијететским суплементима (органске компоненте, гликоген, масти, Ца2+ јони) и компонентама у животној средини (феноли тешки метали)

Преовлађујући ПЦР инхибитори могу се наћи у бактеријама и еукариотским ћелијама, нециљаној ДНК, ДНК-везујућим макромолекулима матрица ткива и лабораторијској опреми као што су рукавице и пластика. Пречишћавање нуклеинских киселина током или после екстракције је пожељна метода за уклањање ПЦР инхибитора.
Данас различита аутоматизована опрема за екстракцију може заменити многе ручне протоколе, али 100% опоравак и/или пречишћавање циљева никада није постигнут. Потенцијални инхибитори могу још увек бити присутни у пречишћеним нуклеинским киселинама или су можда већ ступили на снагу. Постоје различите стратегије за смањење утицаја инхибитора. Избор одговарајуће полимеразе може имати значајан утицај на активност инхибитора. Друге доказане методе за смањење инхибиције ПЦР-а су повећање концентрације полимеразе или примена адитива као што је БСА.
Инхибиција ПЦР реакција може се демонстрирати употребом интерне контроле квалитета процеса (ИПЦ).
Мора се водити рачуна о уклањању свих реагенса и других раствора у комплету за екстракцију, као што су етанол, ЕДТА, ЦЕТАБ, ЛиЦл, ГуСЦН, СДС, изопропанол и фенол, из изолата нуклеинске киселине кроз корак темељног испирања. У зависности од њихове концентрације, они могу активирати или инхибирати ПЦР.