Тестирање метилације ДНК у комбинацији са паметним телефонима за рани скрининг тумора и скрининг леукемије са тачношћу од 90,0%!

Рано откривање рака на основу течне биопсије је нови правац откривања и дијагнозе рака који је последњих година предложио Национални институт за рак САД, са циљем откривања раног рака или чак преканцерозних лезија. Широко се користи као нови биомаркер за рану дијагнозу различитих малигнитета, укључујући рак плућа, гастроинтестиналне туморе, глиоме и гинеколошке туморе.

Појава платформи за идентификацију биомаркера метилационог пејзажа (Methylscape) има потенцијал да значајно побољша постојећи рани скрининг за рак, стављајући пацијенте у најранију фазу лечења.

Недавно су истраживачи развили једноставну и директну платформу за детекцију метилационог пејзажа засновану на златним наночестицама украшеним цистеамином (Cyst/AuNPs) у комбинацији са биосензором заснованим на паметном телефону, што омогућава брз рани скрининг широког спектра тумора. Рани скрининг на леукемију може се извршити у року од 15 минута након екстракције ДНК из узорка крви, са тачношћу од 90,0%. Наслов чланка је Брза детекција ДНК рака у људској крви коришћењем AuNPs са цистеамином и паметног телефона са омогућеним машинским учењем.

Слика 1. Једноставна и брза платформа за детекцију рака путем компоненти Cyst/AuNP може се постићи у два једноставна корака.

Ово је приказано на слици 1. Прво, водени раствор је коришћен за растварање фрагмената ДНК. Цисте/AuNP су затим додате у мешани раствор. Нормална и малигна ДНК имају различита својства метилације, што резултира фрагментима ДНК са различитим обрасцима самосклапања. Нормална ДНК се лабаво агрегира и на крају агрегира Цисте/AuNP, што резултира црвено-помераном природом Цисте/AuNP, тако да се промена боје из црвене у љубичасту може посматрати голим оком. Насупрот томе, јединствени профил метилације ДНК рака доводи до производње већих кластера фрагмената ДНК.

Слике плоча са 96 бунарића снимљене су помоћу камере паметног телефона. ДНК рака је мерена паметним телефоном опремљеним машинским учењем у поређењу са методама заснованим на спектроскопији.

Скрининг рака у стварним узорцима крви

Да би проширили корисност платформе за сензоре, истраживачи су применили сензор који је успешно разликовао нормалну и канцерогену ДНК у стварним узорцима крви. Обрасци метилације на CpG местима епигенетски регулишу експресију гена. Код скоро свих врста рака, примећене су промене у метилацији ДНК, а самим тим и у експресији гена који подстичу туморигенезу, наизменично.

Као модел за друге врсте рака повезане са метилацијом ДНК, истраживачи су користили узорке крви пацијената са леукемијом и здравих контрола како би истражили ефикасност метилационог пејзажа у диференцирању леукемијских карцинома. Овај биомаркер метилационог пејзажа не само да надмашује постојеће методе брзог скрининга леукемије, већ и показује изводљивост проширења на рано откривање широког спектра карцинома коришћењем овог једноставног и директног теста.

Анализирана је ДНК из узорака крви од 31 пацијента са леукемијом и 12 здравих особа. Као што је приказано на оквирном графикону на слици 2а, релативна апсорбанција узорака рака (ΔA650/525) била је нижа од апсорбанције ДНК из нормалних узорака. То је углавном било због повећане хидрофобности која је довела до густе агрегације ДНК рака, што је спречило агрегацију Cyst/AuNP. Као резултат тога, ове наночестице су биле потпуно дисперговане у спољашњим слојевима агрегата рака, што је резултирало различитом дисперзијом Cyst/AuNP адсорбованих на нормалним и агрегатима ДНК рака. ROC криве су затим генерисане варирањем прага од минималне вредности ΔA650/525 до максималне вредности.

Слика 2.(а) Релативне вредности апсорбанције раствора циста/AuNPs које показују присуство нормалне (плава) и канцерогене (црвена) ДНК под оптимизованим условима

(DA650/525) бокс дијаграма; (б) ROC анализа и евалуација дијагностичких тестова. (ц) Матрица конфузије за дијагнозу нормалних и пацијената оболелих од рака. (д) Осетљивост, специфичност, позитивна предиктивна вредност (ППВ), негативна предиктивна вредност (НПВ) и тачност развијене методе.

Као што је приказано на слици 2б, површина испод ROC криве (AUC = 0,9274) добијена за развијени сензор показала је високу осетљивост и специфичност. Као што се може видети из бокс дијаграма, најнижа тачка која представља нормалну ДНК групу није добро одвојена од највише тачке која представља ДНК групу рака; стога је коришћена логистичка регресија за разликовање нормалних и канцерогених група. С обзиром на скуп независних варијабли, процењује се вероватноћа да ће се догађај догодити, као што је канцерогена или нормална група. Зависна варијабла се креће између 0 и 1. Резултат је стога вероватноћа. Вероватноћу идентификације рака (P) одредили смо на основу ΔA650/525 на следећи начин.

где је b=5,3533, w1=-6,965. За класификацију узорка, вероватноћа мања од 0,5 указује на нормалан узорак, док вероватноћа од 0,5 или већа указује на узорак оболелог од рака. Слика 2ц приказује матрицу конфузије генерисану унакрсном валидацијом „оставља се на миру“, која је коришћена за валидацију стабилности методе класификације. Слика 2д сумира евалуацију дијагностичког теста методе, укључујући осетљивост, специфичност, позитивну предиктивну вредност (ППВ) и негативну предиктивну вредност (НПВ).

Биосензори засновани на паметним телефонима

Да би додатно поједноставили тестирање узорака без употребе спектрофотометара, истраживачи су користили вештачку интелигенцију (ВИ) за тумачење боје раствора и разликовање нормалних и канцерогених особа. С обзиром на то, рачунарски вид је коришћен за превођење боје раствора Cyst/AuNPs у нормалну ДНК (љубичаста) или канцерогену ДНК (црвена) користећи слике плоча са 96 бунарића снимљених камером мобилног телефона. Вештачка интелигенција може смањити трошкове и побољшати приступачност тумачења боје раствора наночестица, и то без употребе било каквог оптичког хардвера или додатне опреме за паметне телефоне. Коначно, два модела машинског учења, укључујући Random Forest (RF) и Support Vector Machine (SVM), обучена су за конструисање модела. И RF и SVM модели су правилно класификовали узорке као позитивне и негативне са тачношћу од 90,0%. Ово сугерише да је употреба вештачке интелигенције у биосензорима заснованим на мобилним телефонима сасвим могућа.

Слика 3.(а) Циљна класа раствора снимљена током припреме узорка за корак снимања слике. (б) Пример слике снимљене током корака снимања слике. (ц) Интензитет боје раствора цисте/AuNPs у сваком бунарићу плоче са 96 бунарића издвојеног са слике (б).

Користећи Cyst/AuNP, истраживачи су успешно развили једноставну платформу за детекцију метилационог пејзажа и сензор способан да разликује нормалну ДНК од ДНК рака када се користе узорци праве крви за скрининг леукемије. Развијени сензор је показао да је ДНК екстрахована из узорака праве крви била у стању да брзо и исплативо детектује мале количине ДНК рака (3nM) код пацијената са леукемијом за 15 минута, и показала је тачност од 95,3%. Да би се додатно поједноставило тестирање узорака елиминисањем потребе за спектрофотометром, машинско учење је коришћено за тумачење боје раствора и разликовање нормалних и канцерогених особа користећи фотографију мобилног телефона, а тачност је такође постигнута на 90,0%.

Референца: DOI: 10.1039/d2ra05725e